激光共聚焦扫描显微镜的光学设计

文章编号： 1005-5630（2016）03-0221-05

引 言

激光共聚焦扫描显微镜（LCSM）是以激光作为光源，激光束经照明针孔形成点光源对焦平面上标本进行扫描，标本上的聚焦点在与其共轭的探测针孔的位置成像，这样所得到的共焦图像是样本的光学横断截面的图像。由此可知，激光共聚焦扫描显微镜的成像原理与普通的光学显微镜明显不同，它以抑制焦点外物点信息的光信号来实现高分辨率，再采用扫描技术来弥补视场小的缺点。理想情况下，实现点对点的成像。与普通光学显微镜相比，它可以获得更高的横向分辨率，并且具有较高的纵向分辨率。利用这样的特性，实现了对样品三维结构重建和测量分析的工作，为研究生物组织等物体结构提供了有效的工具。

本文根据LCSM工作原理设计了共聚焦扫描光学系统，并用Zemax对所设计光学系统进行仿真和优化。

1 激光共聚焦工作原理

在共焦显微成像系统中，使用共焦探测针孔不但使得整个光学系统拥有了高分辨轴向响应特性，同时具有抗杂散光和增大对比度的优点。激光共聚焦扫描显微成像系统是利用物镜使光束聚焦形成很小的光点，通过光点与样品之间的相对运动，实现对样品逐点扫描成像。激光共聚焦扫描显微成像采用焦点共轭的技术，使照明针孔、探测针孔、被照射的样品都处在彼此的共轭位置。这样只有在焦平面上的点被光源照射所激发出的荧光能够通过探测针孔而被光电探测器所接收，焦面以外的光线或聚焦在针孔前或聚焦在针孔后，会很大程度地被抑制掉，因此共焦探测针孔的作用相当于一个针孔滤波器，可以极大地提高激光共焦显微成像系统的纵向分辨率。

2 光学系统设计过程

激光共聚焦光学系统由照明光路系统和发射光路系统组成。如图1所示，激光器发出的激光束经过准直扩束透镜组（镜组1、2），变成一束直径较大的平行光束，二向色镜4使光束偏转90°，经过物镜3会聚在其焦点上。样品中的荧光物质在激光激发下发射沿各个方向的荧光，一部分荧光经过物镜、二向色镜、高通滤波片5、聚焦透镜（镜组6）会聚在聚焦透镜的焦点处，再通过焦点处的针孔7，由探测器8接收。

2.1 照明光路设计

2.1.1准直扩束系统

激光准直扩束系统由图1中的镜组1和透镜2组成，其从左到右各面的参数如表1，通过改变光束束腰直径，使激光的准直性、光束平行度变高，且照明针孔位于镜组1的聚焦点处，激光经过此针孔后形成点光源，点光源不仅具有方向性强、发散小、亮度高的特点，而且具有高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。为了得到较小的聚焦光斑，聚焦光路选择两个透镜组合（镜组1）的形式，材料选择ZF14，其聚焦光斑点列图如图2所示，光斑直径小于20 μm。此处照明针孔和探测针孔几何尺寸一致。探测针孔的大小与艾里斑的直径相关，针孔大小为艾里斑经过光学系统成像的大小时，探测器接收光能量较高。

2.1.2 显微物镜

显微物镜是LSCM中最为重要的器件，对成像质量起决定性作用，而数值孔径是判断物镜性能的重要参数，表征物镜的聚光能力，增强物镜的聚光能力，可提高物镜的分辨率。根据初始结构校正轴上点球差，并保证较大的数值孔径。图1物镜3从上到下各面的参数如表2所示，点列图如图3所示。

由图3可知此物镜的像差很小，弥散斑直径小于1 μm。由数值孔径计算公式NA=nsinθ，可得数值孔径为0.69。同时数值孔径决定物镜的衍射分辨率σ的大小，由σ=0.61λNA且物镜的工作波长为405 nm，得其衍射分辨率为0.358 μm。物镜的MTF曲线如图4所示，其接近于衍射极限，因此具有极高的分辨率。 2.1.3照明光路

将准直扩束光路和物镜组合在一起并添加二向色镜的反射面和光阑，得到照明光路的初始结构。其中照明光源是方向性、单色性很好的激光，采用平行入射的方式进入光学系统，因此该照明系统只存在轴上点球差。对该初始结构进行优化时，将准直扩束光路的半径设为变量，在默认评价函数中加入焦距控制操作数，使扩束比例达1.875，然后进行自动优化。再将物镜的所有半径以及像距设为变量，采用默认评价函数优化。优化后的MTF曲线和照明光路点列图如图5，图6所示。由图可知该照明光路的弥散斑直径小于1 μm，MTF曲线接近其衍射极限，因此该照明光路具有极高的点光源分辨率。优化后物镜的数值孔径变为0.686 8。

2.2 发射光路设计

将之前设计的物镜和一个双胶合透镜（镜组6）组合在一起并添加二向色镜的折射面，由此得到了发射光路的初始结构。为进一步优化发射光路（因系统不能改变物镜），只对起聚焦作用的双胶合透镜进行优化。设半径为变量，并逐渐修改厚度，用默认评价函数进行自动优化。优化后的发射光路点列图如图7所示，双胶合透镜从下到上各面的参数如表3所示。

优化后发射光路的MTF曲线分别如图8所示。由图可知弥散斑直径小于20 μm，而探测针孔直径等于艾里斑成像的直径D，即

D=β1.22λNA

式中：β为系统的放大倍率；λ为发射光的波长；NA为物镜的数值孔径。且β=40，λ= 480 nm，NA=0.686 8，由此得D=34 μm，探测针孔直径为35 μm。因此弥散斑直径小于20 μm，满足激光共聚焦探测针孔直径为35 μm的要求。发射光路的MTF曲线接近衍射极限，因此该发射光路具有极高的光学传输效率。

3 结 论

本文设计了激光共聚焦扫描显微镜的光学系统，采用结构较为复杂的物镜以及简单的准直扩束系统和二向色镜反射面实现了照明光路的设计，物镜以及简单的双胶合透镜和二向色镜的折射面实现了发射光路的设计。整个共聚焦系统中照明光路的聚焦弥散斑直径小于1 μm，照明针孔处的聚集光斑直径小于20 μm，满足照明针孔直径为35 μm要求。发射光路的聚集光斑直径小于20 μm，满足探测针孔直径为35 μm的要求，而且照明光路和发射光路的MTF曲线都比较接近衍射极限，优化的较为理想，具有比较好的光学传输效率。因此激光共聚焦扫描显微镜被广泛应用在生命科学、生物技术和纳米科学等领域。然而整个系统的设计也有可以改进的地方，此系统的物镜数值孔径较小，可以进一步提高物镜的的数值孔径，从而提高激光共聚焦光学系统的光学分辨率。

[1]朱延彬.郭周义. 激光共焦扫描显微镜的光学特性研究[J]. 光学仪器.1994.1.