反相高效液相色谱法测定巴洛沙星有关物质的方法学研究

Study on determination of reated substances in baofoxacin by RP- HPLC

巴洛沙星(baofoxacin)系由日本中外制药株式会社与韩国Choongwae公司共同开发的氟喹诺酮类抗菌药，于2002年首次在韩国上市[1～2]。对革兰阳性菌、革兰阴性菌及厌氧菌具有广谱抗菌活性，对细菌具有选择性抑制作用，体外抗菌活性是环丙沙星、氧氟沙星和洛美沙星的4～16倍；与托氟沙星和司帕沙星类似。由于巴洛沙星在其母核的8位引入了一甲氧基，使其不仅增加了对革兰阳性菌的抗菌活性，而且避免或减少光过敏或光毒性及细胞毒性。巴洛沙星是以羧酸乙酯为起始原料，先和三乙酸硼反应生成螯合物Ⅰ，再和3-甲胺基哌啶二盐酸盐缩合反应得螯合物Ⅱ，然后水解制得。该路线是目前制备巴洛沙星的最优路线。测定巴洛沙星的有关物质常用液相色谱法，俞红等报道，用流动相为0.05mo/L柠檬酸-乙腈（60：40）[三乙胺调pH=4]的反相液相色谱法测定主要中间体羧酸乙酯在巴洛沙星中的含量。本实验通过摸索新的色谱条件，采用乙腈-0.4%十二烷基硫酸钠溶液为流动相的高效液相色谱法，能同时测定了巴洛沙星的合成中间体羧酸乙酯、螯合物Ⅰ及螯合物Ⅱ。该方法简单准确、分离效果好，对巴洛沙星的质量控制具有明显的实用价值。巴洛沙星及各中间体的结构式如图1所示。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂 高效液相色谱仪―Waters 515泵；2487紫外检测器。巴洛沙星样品自制，样品批号：20041015、20041020、20041024；对照品自制，含量：99.7%；羧酸乙酯（江阴市永达化工有限公司），螯合物Ⅰ、螯合物Ⅱ均自制；乙腈为色谱纯试剂，其他试剂均为分析纯试剂。

1.2 实验溶液的制备 供试品溶液：取巴洛沙星（批号：20041024）约10.2mg，置100m量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；中间体溶液：取羧酸乙酯14.0mg、螯合物Ⅰ11.3mg、螯合物Ⅱ10.3mg，分别置100m量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；混合溶液：取供试品溶液及各中间体溶液各1份，混合，即得。

图1 巴洛沙星及中间体的结构式

Fig. 1 Structura formua of baofoxacin and intermediates

1-巴洛沙星；2-羧酸乙酯；3-螯合物Ⅰ；4-螯合物Ⅱ1.3 色谱条件 色谱柱：SMT C18柱（5μm，4.6mm×250mm）；流动相：乙腈-0.4%十二烷基硫酸钠溶液(47：53)[用枸橼酸（1.5mo/L）调pH值至3.0]；检测波长：295nm；流速：1.0m/min；柱温：室温；进样量：20μ。

2 结果与讨论

2.1 测定波长的选择 分别称取巴洛沙星及各中间体适量，分别加乙腈溶解制成每1m中约含6μg的溶液，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录ⅣA)，在200～400nm的波长处扫描，结果显示巴洛沙星在295nm处吸收最强，且其他中间体在295nm附近有较大的吸收，故选择295nm为本品有关物质测定的检测波长。

2.2 色谱柱及流动相的选择 色谱柱：(1)DiamonsiTM C18柱（5μm， 4.6mm×200mm）；(2)Kromasi C18柱（5μm， 4.6mm×200mm）；(3)SMT C18柱（5μm， 4.6mm×250mm）。流动相：(1)参照中国药典2000年版二部沙星类药物有关物质测定，采用流动相：乙腈-0.05mo/L枸橼酸溶液(20： 80)[用三乙胺调pH值至3.5]；(2)乙腈―0.4%十二烷基硫酸钠溶液（47：53）[用枸橼酸（1.5mo/L）调pH值至3.0]。

采用上述不同的色谱柱和流动相进行实验，结果表明：采用色谱柱(1)或(2)及流动相(1)，虽然主峰出峰时间适中且峰形较好，但各中间体在此流动相中50min都未见出峰；采用色谱柱(1)或(2)及流动相(2)，样品及各中间体出峰时间适中，但峰拖尾严重；采用色谱柱(3)及流动相(2)，样品及各中间体出峰时间适中，且峰形较好。所以选择采用色谱柱(3)及流动相(2)来检测本品的有关物质。

2.3 系统适用性试验 取1.2项溶液各20μ分别注入液相色谱仪进行测定，并记录色谱图，测定结果见表1及图2。试验结果表明：巴洛沙星与各中间体在上述色谱条件下能有效地分离。

表1 巴洛沙星与中间体液相色谱保留时间

Tab.1 Chromatograms retention time of baofoxacin and reated substances

图2 巴洛沙星有关物质系统适用性试验HPLC图

Fig. 2 Chromatograms obtained from the system appicabiity test of reated substances in baofoxacin

1-螯合物Ⅰ；2-羧酸乙酯；3-螯合物Ⅱ；4-巴洛沙星