羊卵泡卵母细胞孤雌激活研究

The study on parthenogenetic activation of sheep oocytes

卵母细胞体外受精和孤雌激活是胚胎工程研究领域获得胚胎的两条重要途径，卵母细胞正常受精时，精子与卵子质膜直接融合或通过表面上的受体蛋白引起卵内Ca2+浓度的瞬时升高，由此引起包括皮质颗粒（CG）释放、细胞质内pH的改变、母源mRNA的补充等一系列激活反应，最终导致原核的形成、DNA合成的起始和卵裂；卵母细胞孤雌激活是一种人工激活卵的方式，通过电脉冲、Ionomycin、乙醇、钙离子载体、放线菌酮和1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）等都可以引起卵母细胞的激活，使MII期卵母细胞不经过受精过程完成早期胚胎发育，获得孤雌胚胎。

孤雌激活与体外受精都是以MII期卵母细胞为起点，都能获得早期胚胎，但孤雌激活与体外受精存在本质的区别；前者是人工活化卵母细胞，后者是自然活化卵母细胞；孤雌激活胚是通过抑制第二极体排放，使其与原来的卵母细胞核融合构成二倍体的胚胎，而体外受精胚胎是由雌雄配子融合所获得的胚胎，孤雌激活和体外受精是两项相对独立的技术但又有密切的联系。

目前大部分哺乳动物体外受精产生胚胎的发育率和妊娠率都比较低，但有试管动物相继诞生；孤雌生殖的动物个体仅获得早期胚胎，还没有妊娠成功的报道。本研究针对影响孤雌激活的主要因素，比较了Ionomycin、乙醇与6-DMAP对成熟卵母细胞的激活效果，旨在建立一套快速、便捷的卵母细胞体外激活方法，提高孤雌激活的效果与可操作性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要仪器 体视显微镜：日本NICON，SMZ800-C-EPI；CO2培养箱：美国，Forma scientific 3336型；双人单面垂直流超净台：上海，ZHJH-1115。

1.1.2 试剂与耗材 一次性塑料培养皿为Nuncon公司产品；培养用TCM199和胎牛血清（FBS）由Gibco公司生产，其他所有化学试剂除特别指明外，均为Sigma公司生产；FSH、LH和17 -E2购自宁波激素制品公司。

1.1.3 操作液

1.1.3.1 卵母细胞成熟液 TCM-199，HEPES 10mM，丙酮酸钠0.38mM，FBS 10%，17 -E2 1g/m，LH 20g/m，FSH 10μg/m，青霉素100U/m，硫酸链霉素100U/m。

1.1.3.2 胚胎培养液 SOFaa胚胎培养液为基础液，另加HEPES 10 mM，5% FBS，EDTA 0.1 mM，青霉素100U/m，硫酸链霉素100U/m。

1.2 实验方法

1.2.1 卵母细胞成熟与孤雌激活前处理 卵母细胞采集后成熟培养23～24h后，去除卵母细胞外的所有卵丘细胞，挑选明显具有第一极体的成熟卵母细胞进行孤雌激活试验。

1.2.2 孤雌胚体外培养 各种处理后的卵母细胞放入预先制备好的颗粒细胞单层的胚胎培养液微滴内进行共培养，每48h半量换液1次。

1.2.3 实验设计与结果统计 本研究针对用于卵母细胞孤雌激活的两种常用方法，比较了Ionomycin、乙醇与6-DMAP不同浓度组合对卵母细胞激活效果的影响，试验设计具体如下。

实验1：Ionomycin与不同浓度6-DMAP联合对卵母细胞激活效果的影响。

选择成熟良好且去除卵丘细胞的卵母细胞，在含5μM Ionomycin的胚胎培养液内激活5min，用胚胎培养液洗3次后，移入含有0.5mM、1.0mM、2.0mM和3.0mM 6-DMAP的胚胎培养液内培养4h，然后用无Ionomycin和6-DMAP的胚胎培养液洗涤3次，移入正常胚胎培养液中培养，于培养后24h检查卵裂率。

实验2：乙醇与不同浓度6-DMAP联合对卵母细胞激活效果的影响。

选择成熟良好且去除卵丘细胞的卵母细胞，在含7%乙醇的胚胎培养液内激活5min，用培养液洗3次后，移入含有0.5mM、1.0mM、2.0mM和3.0mM 6-DMAP的胚胎培养液内培养4h，然后用无乙醇和6-DMAP的胚胎培养液洗涤3次，移入正常胚胎培养液中培养，分别于培养后24h检查卵裂率。

实验3：6-DMAP不同处理时间对卵母细胞激活效果的影响。

以以上实验为基础，在Ionomycin和乙醇最佳激活浓度下，比较6-DMAP不同处理时间对卵母细胞激活效果的影响。

以上所有实验重复5批，每批重复卵母细胞同批采样、同批成熟、同皿分区50μ微滴培养，同一处理的卵母细胞在同一个微滴中培养，每个微滴中卵母细胞数量相等。

实验数据采用邓肯法多重均值比较，SAS统计软件统计分析。

2 实验结果

2.1 Ionomycin与不同浓度6-DMAP联合对卵母细胞激活效果的影响 Ionomycin与不同浓度6-DMAP联合对卵母细胞激活见表1。

表1 Ionomycin与不同浓度6-DMAP对卵母细胞激活效果的影响

注：上标字母a，b，c表示0.01水平差异显著性检验，两组间有相同字母表示差异无显著性（P＞0.01）

由表1的统计结果可以看出，Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和 Ⅳ组的卵裂率分别是26.36%、32.73%、40.91%和37.27%，从Ⅰ组～Ⅲ组随6-DMAP浓度增大，卵母细胞孤雌激活的卵裂率显著增加（P＜0.01），Ⅲ组和 Ⅳ组的卵裂率差异不显著（P＞0.01），Ionomycin与6-DMAP联合作用激活卵母细胞6-DMAP的浓度以2.0mM为宜。

2.2 乙醇与不同浓度6-DMAP联合对卵母细胞激活效果的影响 乙醇与不同浓度6-DMAP联合对卵母细胞激活效果见表2。

表2 乙醇与不同浓度6-DMAP对卵母细胞激活效果的影响

注：上标字母a，b，c表示0.01水平差异显著性检验，两组间有相同字母表示差异无显著性（P＞0.01）

由表2的统计结果可以看出，Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和 Ⅳ组的卵裂率分别是19.79%、27.08%、39.58%和37.50%，从Ⅰ组～Ⅲ组随6-DMAP浓度增大，卵母细胞孤雌激活的卵裂率显著增加（P＜0.01），Ⅲ组和 Ⅳ组的卵裂率差异无显著性（P＞0.01），7%的乙醇与6-DMAP联合作用激活卵母细胞6-DMAP的浓度也是以2.0 mM为宜。

综合比较表1、表2结果，Ionomycin对卵母细胞激活效果显著强于乙醇。