乙醇对小鼠原代肝细胞脂肪酸氧化速度的影响

The effect of ethano on fatty acid oxidation of mice primary hepatocytes

肝脏在脂肪、糖和蛋白质的代谢过程中具有重要的作用。在体内肝细胞的代谢受到各种因素的影响。酒精在人肝细胞中主要由乙醇脱氢酶和过氧化氢酶代谢成具有细胞毒性的乙醛，然后由乙醛脱氢酶代谢为乙酸。在这个过程中，肝脏的糖脂代谢将受到影响。本研究通过体外分离肝细胞和培养，研究乙醇对肝细胞的脂肪酸氧化速度的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 C57BL/6小鼠由第四军医大学实验动物中心提供；戊巴比妥钠、胶原酶、胰岛素、异丙肾上腺素，棕榈酸为Sigma公司；[9，10-3H]Pamitic acid为Amersham Bioscience产品；Hisafe 3闪烁计数液为PE公司产品。

1.2 肝细胞的分离 取C57BL/6小鼠，采用戊巴比妥钠（100mg/kg）麻醉；打开小鼠腹腔，向左侧移开小肠，暴露下腔静脉和门静脉，使用3号丝线从肾静脉近端绕过下腔静脉；采用21号套管针从下腔静脉传入，直至接近肝静脉；用丝线固定套管针，采用含有1mM EGTA和0.1%葡萄糖的Kreb-Ringer缓冲液灌注肝脏，同时迅速切断门静脉使灌注液从门静脉流出，灌注压力为20cm水柱，灌注速度为4m/min；灌注20m后更换含有0.5mg/m胶原酶和5mM CaC2的灌注液继续灌注10min，立刻小心取出肝脏，置于含有Kreb-Ringer缓冲液的10mM培养皿中，用剪刀剪开肝脏包膜，轻轻晃动使肝细胞释放出来；采用70μm的细胞滤器过滤；使用10%FBS的DMEM洗涤细胞2次，50×g离心。

1.3 存活性鉴定 分离后的肝细胞立刻用4%台盼蓝染色，在显微镜下观察，核呈蓝色为死细胞，拒染的细胞为活细胞，将细胞接种于胶原包被的12孔培养皿中，采用含有10%胎牛血清，100u/m青霉素和链霉素的DMEM培养液，在5%CO2，37°C培养。

1.4 形态学观察 （1）脂肪染色：取不同培养时间的肝细胞，4%多聚醛溶液固定，油红O（Oi Red O）染色，再用苏木精衬染细胞核，缓冲甘油封片后，观察肝细胞中脂肪的含量。（2）苏木精-伊红（HE）染色：固定的肝细胞用苏木精-伊红染色，脱水透明后，观察不同生长时间的细胞形态变化。

1.5 脂肪酸氧化速度 肝细胞脂肪酸氧化速度根据文献进行，将分离的肝细胞接种到12孔细胞培养板中，2 ×105/孔，细胞贴壁12h后开始测定肝细胞脂肪酸的氧化速度。先用PBS洗涤细胞2次，每孔加入500μ含有0.5mg/m BSA，22μM [9，10(n)-3H]棕榈酸 (1μCi/孔)的Hanks液，试验孔中同时加入20mM乙醇，每组3个复孔。37°C培养2h后将培养液立即转移到玻璃试管中，并采用0.5m Hanks液洗涤细胞2次，将洗涤液也加入玻璃试管中。采用Foch法抽提脂肪酸，每管中加入8m 甲醇/氯仿(2:1)和0.5m 2 M KC/2 M HC溶液。剧烈混合30min后离心，将上层水相转移到一个新的玻璃试管中，继续采用甲醇/氯仿抽提一次，将水相转移到闪烁瓶中，加入10m闪烁液，混合后采用闪烁计数器测定脂肪酸氧化后生成的3H2O量。肝细胞的蛋白含量采用Brad-ford法进行测定。

2 结果

2.1 分离肝细胞存活率 肝细胞分离的存活率，大于95%。

2.2 形态学观察结果 分离的肝细胞，在培养12h后即能够充分贴壁生长。肝细胞在生长的早期（24～48h）细胞状态较好，可见明显细胞极性，细胞排列生长。细胞生长后期（>4天），肝细胞生长出现排列紊乱，细胞突触增多，并可见细胞分裂像。

图1 体外培养的肝细胞形态

Fig 1 the morphoogy of cutured primary hepatocytes

A: Cutured 24 hr; B: Cutured 96 hr; C: the division the hepatocytes

2.3 乙醇对肝细胞脂肪酸氧化速度的影响 乙醇能够明显抑制肝细胞的脂肪酸氧化速度，正常培养的肝细胞脂肪酸氧化速度为3.12nmo/mg protein/h，而在20mmo/L的乙醇存在的情况下脂肪酸氧化速度为1.76pmo/mg protein/h，降低约40%左右，具体结果见图2。

图2 乙醇对体外培养肝细胞脂肪酸氧化速度的影响

Fig 2 The effect of ethano to the rate of fatty acid oxidation of cutured hepatocytes