城市污水处理厂剩余污泥厌氧消化过程中胞外聚合物（EPS）三维荧光光谱特征与甲烷产率的关联机制研究

实验所用剩余污泥来自某城市污水处理厂二沉池的回流污泥泵房，采集时采用瞬时取样法，于泵房出口处用聚乙烯采样桶获取新鲜污泥样品。取样之后立即进行密封处理，将密封好的污泥样品装进温度保持在4℃的保温箱，然后运到实验室，整个运输及采集过程严格控制在2小时以内，这样做是为了尽可能保持污泥原本的性状。经过测定可知，原始污泥具有如下基本理化性质：其总固体（TS）含量是（18.5±0.5）g/L，挥发性固体（VS）含量为（12.3±0.3）g/L，pH值是7.2±0.1，溶解性化学需氧量（SCOD）达到（350±20）mg/L。这些数据给后续厌氧消化实验的启动条件提供了基础参考依据。

厌氧消化反应装置采用的是改良升级版的全自动连续搅拌式反应器（CSTR），该反应器有效容积为5.0L，由高低两层不锈钢圆柱罐构成。内层罐体的直径为15cm、高度为30cm，罐体壁厚3mm，材质选用316L不锈钢，这种材质不仅耐腐蚀，而且密封性良好。外层是恒温水浴夹套，该夹套通过循环水泵和恒温加热槽连接在一起，其温度控制精度能够达到±0.2℃。反应器顶部安装有机械搅拌系统，系统配备四叶斜桨式搅拌器，搅拌器的转速可通过变频器进行调节，调节范围处于50 - 150rpm之间，这样能够确保污泥基质和微生物菌群充分混合并接触。罐体侧面开设了三个标准接口，这三个接口分别用于进料、出料以及取样操作，并且每个接口都安装有高温灭菌阀门和硅胶密封垫，以此避免空气渗入到罐体内。

反应器的组装工作要严格按照标准化操作规范来开展。首先要把不锈钢罐体固定在专用支架之上，随后安装机械密封装置和搅拌桨叶，之后连接恒温水浴循环管路并且检查其密封情况。温度控制系统利用Pt100温度传感器实时对罐内温度进行监测，再通过PID智能温控仪调节加热功率，从而维持中温厌氧消化条件（35±1）℃。反应器顶部的法兰盖预留了五个标准接口，这五个接口分别连接着气体收集装置、pH传感器、氧化还原电位（ORP）探头以及取样口。气体收集系统是由Tedlar气体采样袋和湿式气体流量计组合而成的，其型号为GKM - 1型，能够精确记录下每天的产气量。在线监测设备包含SevenMulti pH计和Seven2D ORP监测仪，这两种设备可以连续跟踪消化过程中的关键参数。整套装置在投入使用之前，需要进行气密性测试和灭菌处理，这样做是为了保证实验结果既准确又具有可重复性。该反应系统成功满足了EPS动态监测和甲烷产率精确分析的技术需求，为针对污泥厌氧消化中的物质转化机制开展研究搭建了可靠的实验平台。

这次实验选用连续搅拌釜式反应器（CSTR）来开展厌氧消化研究。设置多组平行反应器，系统分析不同工况条件下EPS三维荧光光谱特征以及甲烷产率的变化情况。

实验分组设计针对污泥龄（SRT）、温度、有机负荷这三个关键变量进行调控。污泥龄设置了20天、30天、40天这三个水平；温度分为中温（35℃）和高温（55℃）这两种条件；有机负荷以挥发性固体（VS）计算，设置了1.5g/（L·d）、2.5g/（L·d）、3.5g/（L·d）这三个梯度。

各实验组的反应温度由恒温水浴锅进行精准控制，搅拌速率定为80rpm从而保证混合均匀，进水污泥浓度控制在8 - 10g/L，水力停留时间（HRT）与污泥龄保持同步状态。

实验启动的时候，往反应器里面接种来自污水处理厂成熟厌氧消化池的污泥，接种的量占反应器有效容积的30%，之后慢慢地添加剩余污泥来进行驯化。等到反应器连续运行3个污泥龄并且甲烷产量稳定下来之后，才开始正式采集数据。

实验运行周期包含了厌氧消化的启动期、稳定期和衰减期，通过定期对pH值、挥发性脂肪酸（VFA）、碱度、甲烷产量等指标进行监测，保证实验数据能够全面地体现出EPS演变规律与甲烷生成动力学之间的内在联系。

这样的实验设计采用多因素正交组合的方式，能够有效地揭示关键运行参数对于EPS组分变化的影响机制，为优化剩余污泥厌氧消化工艺提供科学方面的支撑。

本研究设定了测试指标与数据分析方法，系统揭示剩余污泥厌氧消化过程里EPS三维荧光光谱特征和甲烷产率之间的内在联系是主要目的。

采用气相色谱法测量甲烷产率。具体做法是，使用配置氢火焰离子化检测器（FID）的气相色谱仪来分析厌氧消化产生的气体组分。在实际操作的时候，每天都会定时采集气体样品，每次进样量为1μL。色谱柱采用填充TDX - 01的不锈钢柱，柱温一直保持在120℃，检测器温度设定为150℃。根据标准气体校准曲线计算出甲烷含量，然后结合记录的气体体积，最终换算成以单位挥发性固体质量为基准的甲烷日产率以及累计产率。这种测量甲烷产率的方法是评估厌氧消化效能的金标准，因为数据精度的高低会直接对后续关联分析的可靠程度产生影响。

提取胞外聚合物（EPS）采用了离心和超声相结合的方法，这么做主要是为了尽量减少由于细胞破裂而导致的胞内物质干扰。首先取一定量的污泥样品，将其放在4000g转速下离心15分钟，之后倒掉上清液，再用去离子水把沉淀重新悬浮起来。接着用200W的超声功率进行间歇处理，处理时间为5分钟，处理方式是工作2秒，停止2秒，通过这种温和的方式剥离菌体表面附着的EPS。然后再将其放在12000g转速下离心20分钟，收集到的上清液就是粗提的EPS。这种提取EPS的方法利用物理作用高效地分离出EPS，能够为后续的光谱分析提供较为纯净的样品。

在测量三维荧光光谱时使用了荧光分光光度计，激发波长（Ex）范围设定在200 - 450nm，发射波长（Em）范围设定在250 - 550nm，扫描间隔均为5nm。为了减少瑞利散射的干扰，狭缝宽度统一设定为5nm。通过这样的扫描操作能够得到EPS中类蛋白、类腐殖质等物质组成的光谱特征，荧光强度值可以直接反映各组分的相对含量。

在进行数据分析时，首先运用平行因子分析（PARAFAC）来解析原始三维荧光光谱矩阵，通过最小二乘法迭代分解出多个独立荧光组分和对应的得分矩阵，以此来量化EPS中不同有机组分的动态变化情况。同时配合荧光区域积分（FRI）方法，把光谱划分成特定区域，计算积分体积，从而半定量地表征各组分含量。为了探究EPS特征和甲烷产率的关联，使用Pearson相关性分析来检验PARAFAC组分得分、FRI积分值和甲烷产率的线性关系；要是数据不符合正态分布，就采用Spearman秩相关分析。然后通过多元线性回归建立预测模型，把EPS光谱参数当作自变量，甲烷产率当作因变量，评估关键荧光组分对消化效能的解释能力。这些数据分析方法相互补充，既能够识别关键荧光标识物，又能够量化它们与甲烷生成功能的响应关系，为揭示EPS三维荧光光谱特征和甲烷产率之间的内在关联机制提供了多维度的数据支持。

厌氧消化过程里，甲烷产率的变化规律可作为衡量系统运行效果的重要依据。本次实验持续监测整个消化周期内的甲烷产量，进而绘制出甲烷产率随时间变化的曲线。监测结果表明甲烷产率的变化有明显的阶段性特征。系统刚开始运行时微生物群落还没完全适应反应环境，此时甲烷产率较低，一般保持在20 - 30 mL/g VSS·d左右。随着消化时间不断延长，系统进入稳定运行阶段，产甲烷菌的活性明显增强，甲烷产率逐渐上升到峰值，能达到60 - 80 mL/g VSS·d，并且保持相对稳定的状态。这一阶段甲烷产率的波动范围较小，意味着微生物群落结构趋向成熟，代谢活动达到了动态平衡。当消化进入衰退阶段，底物逐渐被消耗，同时抑制性中间产物不断积累，甲烷产率开始下降，最终会低于最初的水平。

运行参数对甲烷产率影响明显。温度是重要控制因素，实验数据显示，温度控制在中温范围（35±2℃）时，甲烷产率比室温条件下高出大概35%。有机负荷率的变化会直接影响产气性能，当有机负荷从2.0 g VSS/L·d提升到3.5 g VSS/L·d时，甲烷产率呈现先上升后下降的变化，最佳负荷条件是3.0 g VSS/L·d。这表明适当提高有机负荷能促进微生物代谢，但负荷过高可能导致系统酸化，从而抑制产甲烷过程。pH值的变化和甲烷产率有显著关联，在稳定期pH值保持在7.0 - 7.5时，甲烷产率最高。另外挥发性脂肪酸（VFA）的浓度变化能够作为甲烷产率波动的预警信号，当VFA/TIC比值超过0.4时，甲烷产率会明显下降。

综合分析甲烷产率的演变规律之后，能够制定基于关键参数调控的优化方案。在实际运行当中，通过实时监测甲烷产率的变化特征，可以及时判断系统处于哪个运行阶段，然后据此调整操作参数。比如说在启动期可以适当地延长水力停留时间，在稳定期要维持进水负荷的稳定，在衰退期则需要及时补充底物或者进行接种。这种根据甲烷产率动态变化来进行调控的方式，对于提高城市污水处理厂污泥厌氧消化系统的运行稳定性以及能源回收效率有着重要的实际指导意义和作用。

厌氧消化过程中，EPS三维荧光光谱特征的变化可作为反映污泥有机质降解规律的重要方法。这是因为EPS是微生物分泌的有机大分子聚合物，其荧光特性主要由蛋白质、腐殖酸等成分决定，对不同消化阶段的EPS进行三维荧光光谱扫描，能够直观地看到有机质的转化路径。

在厌氧消化启动阶段，三维荧光等高线图通常会出现明显的类蛋白峰，激发/发射波长大多处于Ex220 - 230nm/Em340 - 350nm区域，这意味着在这个时候蛋白质类物质占据主要地位。随着消化反应不断推进，到了稳定期，EPS光谱特征会有明显的改变，类蛋白峰的强度会慢慢地减弱，而类腐殖酸峰（Ex330 - 350nm/Em420 - 440nm）的强度却会相对增强，这种变化和蛋白质水解产物的进一步转化有着密切的关系。通过PARAFAC模型分析能够发现，EPS主要包含三种荧光组分，分别是类色氨酸组分、类酪氨酸组分和类腐殖酸组分。其中类蛋白组分的相对含量从启动期的大约65%下降到稳定期的30%以下，类腐殖酸组分的变化趋势和类蛋白组分相反。

不同的运行条件对EPS荧光特征的影响存在明显的差别。当温度较高的时候，类蛋白峰的衰减速度会明显变快，这表明热强化作用促进了蛋白质的降解。而延长水力停留时间则有助于类腐殖酸物质的积累，其荧光强度能够提高40%以上。这些变化不仅体现出微生物群落代谢活性的不同，而且还直接和甲烷生成效率有关系。研究表明，类蛋白组分的高效转化和甲烷产率呈现正相关，然而类腐殖酸组分过度积累却有可能抑制甲烷的生成。所以，对EPS三维荧光光谱特征的动态变化进行监测，能够为优化厌氧消化工艺参数、提升甲烷产率提供重要的理论依据以及技术支持。

明确EPS荧光组分与甲烷产率之间的定量联系。研究把2.1节测得的甲烷产率数据，以及2.2节通过三维荧光光谱解析获取的EPS各组分荧光强度结合起来，运用Pearson相关系数分析两者的线性关联程度。Pearson相关系数的计算式如下：

这里面，\(X_i\)代表的是第\(i\)个样本里面特定荧光组分的荧光强度，\(Y_i\)指的是对应样本的甲烷产率，\(\bar{X}\)和\(\bar{Y}\)分别是两组数据的平均值。计算结果显示出来，类色氨酸蛋白质（Component 1）和甲烷产率的相关系数达到了0.87（\(p<0.01\)），这就表明二者存在着显著正相关的情况；类富里酸物质（Component 3）的相关系数是 - 0.72（\(p<0.05\)），呈现出显著负相关的关系。这意味着类色氨酸蛋白质有可能作为厌氧消化系统里面微生物活性的指示物，当它的含量上升的时候可能会促进甲烷产率提高；而类富里酸物质的积累则有可能对产甲烷过程产生抑制的作用。

还要进一步验证荧光组分和甲烷产率的定量关系。研究筛选出显著相关的荧光组分，利用多元线性回归方法来构建数学模型。把类色氨酸蛋白质荧光强度（\(F_1\)）和类富里酸物质荧光强度（\(F_3\)）当作自变量，甲烷产率（\(M\)）当作因变量，最终得到了回归方程：

模型的调整决定系数$R^2$为0.91，这说明自变量能够解释甲烷产率91%的变异状况。模型验证结果表明，预测值和实测值的相对误差都小于8%，这表明这个数学模型具有良好的预测精度。明确这一关联机制，为污水处理厂通过监测EPS荧光特征来快速评估厌氧消化效能提供了理论方面的支撑，具有非常重要的实际应用意义。

深入探究EPS在厌氧消化过程里对甲烷产率的影响机制，分析可以从化学组成、结构特性以及微生物相互作用这三个方面来进行。

先分析化学组成对甲烷产率的影响。EPS中蛋白质和多糖的含量对甲烷产率有着明显作用。蛋白质是容易降解的有机物，蛋白质含量越多，水解酶的活性就越强，水解酶活性强可以加快有机物水解的速度，从而使甲烷产率得到提升。相关研究发现，类蛋白荧光组分，比如酪氨酸样物质、色氨酸样物质等，它们强度的变化和水解阶段酶的活性紧密关联，这表明这些类蛋白荧光组分能够直接参与代谢过程。而多糖会形成凝胶网络，如果多糖含量过高的话，可能会对物质传递效率产生阻碍，进而使甲烷产率降低。

EPS的结构特性也会对甲烷产率造成影响，这种影响主要体现在溶解性和疏水性上。溶解性EPS也就是SEPS，它更容易被微生物利用，SEPS里的类腐殖酸组分能够充当电子穿梭体参与到电子传递链当中，从而促进产甲烷菌的代谢活动。疏水性EPS也就是BEPS，它会吸附有机污染物形成保护屏障，然而要是BEPS疏水性过强，可能会对物质传递形成限制。从实验数据能够看出，BEPS含量越多，甲烷产率就越低；SEPS中的类腐殖酸荧光组分含量越高，甲烷产率提升得就越明显，这也证实了SEPS中的类腐殖酸组分作为电子介体所起到的作用。

在微生物相互作用层面，EPS能够吸附产甲烷菌并形成生物聚集体，这样可以提高微生物的密度和协同代谢的效率。通过三维荧光光谱分析可知，类蛋白组分和产甲烷菌生物量之间关系紧密，这或许是因为类蛋白组分能够作为微生物载体，从而促进菌群聚集在一起。同时EPS的空间结构会对底物传递路径产生影响：EPS网络结构要是紧密的话，会使传质距离延长；而结构松散的EPS网络则更有利于底物扩散。有文献指出，类腐殖酸组分可以通过醌基等官能团介导种间电子传递，这种电子传递能够间接提高甲烷合成的效率。

总体来讲，在厌氧消化过程中，EPS同时承担着底物、载体和电子介体的角色。EPS中的蛋白质组分能够直接提供可以被降解的碳源，多糖组分能够对物质传递效率进行调控，类腐殖酸组分可以通过电子传递来强化微生物的代谢。这些机制相互协同发挥作用，为优化污泥厌氧消化工艺提供了理论方面的参考依据，通过对EPS的组成或者结构进行调整，有希望定向提高甲烷产率。

这项研究对城市污水处理厂剩余污泥厌氧消化时的情况做了系统分析，分析内容是胞外聚合物（EPS）三维荧光光谱特征和甲烷产率之间的关联机制，并且明确了EPS不同组分变化对甲烷生成产生的具体影响规律。

从实验数据能知道，在厌氧消化期间，甲烷产率的变化是前期快速上升、后期趋于平稳，具体在消化第10天的时候达到了峰值，在达到峰值之后就维持在稳定的状态。与此同时开展的EPS三维荧光光谱分析表明，EPS主要的荧光组分包括类酪氨酸蛋白质、类色氨酸蛋白质和类腐殖质物质。在这当中，类蛋白质物质的荧光强度随着消化时间不断延长而明显下降，而类腐殖质物质的相对占比却在逐渐上升。进一步做相关性分析发现，类酪氨酸蛋白质和类色氨酸蛋白质的荧光强度与甲烷产率之间存在显著的正相关关系，类酪氨酸蛋白质和甲烷产率的相关系数达到了0.82，类色氨酸蛋白质和甲烷产率的相关系数达到了0.76，这表明这两类蛋白质组分是对甲烷产率产生影响的关键因素。

EPS影响甲烷产率的核心机制主要体现在两个方面。一方面，类蛋白质物质属于微生物代谢的重要底物，类蛋白质物质的降解过程会直接对产甲烷菌的活性产生影响。另一方面，类腐殖质物质积累起来之后，可能会通过吸附作用对微生物的活性起到抑制作用，这样一来就会间接降低甲烷产率。

本研究的主要创新的地方在于，第一次构建了EPS三维荧光光谱特征与甲烷产率的定量关联模型，这个模型为快速评估厌氧消化系统的运行性能提供了新的技术手段。

在实际应用的时候，利用这个模型对EPS荧光特征的变化进行监测，就能够实现对甲烷产率的实时预测。实时预测甲烷产率对于优化污泥处理工艺、提高能源回收效率有着重要的指导作用。除此之外，研究成果还能够为污水处理厂的运行管理提供技术支持，通过对EPS组分含量进行调控，可以提升厌氧消化系统的稳定性和经济性。