银杏萜类内酯含量测定使用外标四点法可靠性的探讨

Study on reiabiity of ESM of four points to determine the assay for Ginkgo Terpene Lactones

有关银杏叶中萜类内酯的含量测定方法的报道较多，目前银杏叶制剂的萜类内酯含量测定方法采用的多为HPLC法[1～3]。我们亦采用2005版中国药典收录的HPLC法，蒸发光散射检测器进行测定。HPLC-ELSD使用外标两点法对数方程分别计算白果内酯、银杏叶内酯A、银杏叶内酯B和银杏叶内酯C的含量，四种银杏内酯的含量之和为萜类内酯含量。我们在实际工作中使用外标两点法时，直接从数值上难以判断对照溶液的配制是否准确，及其外标两点法对应的工作曲线(n＝2)是否可靠。因此，同时配制两份对照溶液各自分别测定5μ、10μ两点，将四个浓度和相应峰面积一条标准曲线（n＝4），得出回归方程及相关系数r，通过统计学方法考察曲线和回归方程是否成立。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪：SHIMADZU-10A；蒸发光散射检测器ALLTECH ELSD2000。

1.2 试药 白果内酯，银杏叶内酯B、银杏叶内酯C对照品购于中国药品生物制品检定所；银杏叶内酯A对照品购于SIGMA。甲醇为色谱纯；水为自制超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适应性试验 色谱柱：ALLTECH C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：正丙醇-四氢呋喃-水(1：15：84)；流速1.0m/min；ELSD参数：漂移管温度108.0℃；载气(压缩空气)流速3.10L/min；柱温35℃；进样量5、15μ。理论塔板数按白果内酯峰计算应不低于2500，相邻峰的分离度应＞1.5。

2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取经五氧化二磷干燥过夜的白果内酯、银杏叶内酯A、银杏叶内酯B和银杏叶内酯C对照品适量，置同一10m量瓶中加甲醇稀释至刻度，混匀，即得。

2.2.1 对照品溶液一 白果内酯22.73mg、银杏内酯A 13.42mg、银杏内酯B 11.13mg和银杏内酯C 9.05mg。

2.2.2 对照品溶液二 白果内酯14.71mg、银杏内酯A 11.34mg、银杏内酯B 12.24mg和银杏内酯C 18.99mg。

以对照品浓度的自然对数InC(x)为横坐标，峰面积的自然对数InA(y)为纵坐标作图，见图2～5。

图中四点有成一条直线的趋势，在直线方程y＝ax+b中，通过统计计算按公式1、2、3分别求出两个常数a，b及直线的相关系数r，见表2。

2.3 外标四点法直线回归方程的确定 分别精密吸取对照品溶液一和二5μ、15μ，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录色谱图。结果：对照溶液中白果内酯(tR＝8.375)、银杏叶内酯A(tR＝9.811)、银杏叶内酯B(tR=12.040)和银杏叶内酯C(tR＝7.194)，相邻组分分离效果良好。浓度与峰面积的数据及处理见表1。

图1 萜类内酯对照溶液HPLC图

(出峰顺序为银杏内酯C，白果内酯，银杏内酯A，银杏内酯B)

表1 对照进样量(μg)与峰面积

图2~5

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2.4 直线回归方程的统计学检验

2.4.1 相关系数检验法 相关系数表示两变量间关系的密切程度。使用相关系数检验法来进行相关系数的显著性测验。见表2。