核酸疫苗与寄生虫核酸疫苗的研究进展

核酸疫苗就是将编码某种特异抗原的外源基因克隆到真核表达质粒上，然后把该重组质粒接种于机体，使这一外源基因在宿主体内表达，产生抗原刺激机体免疫系统，诱导特异性免疫反应。核酸疫苗是继灭活疫苗、减毒活疫苗和基因工程重组蛋白疫苗之后的第3代疫苗。1994年5月世界卫生组织全球疫苗和免疫规化等三个机构在日内瓦联合召开核酸疫苗会议,与会者充分肯定了核酸疫苗的潜在应用价值。核酸疫苗具有许多突出的优点：①能表达天然蛋白抗原，形成正确的折叠和翻译后糖基化等修饰,递呈给宿主免疫系统与自然感染过程相似，更接近天然分子形式，包括构型相关位点，因而能诱导更有效的免疫应答。②可诱导出全方位免疫，包括细胞免疫和体液免疫，核酸疫苗免疫后，可检测出较高滴度的特异性抗体和CTL反应。③生产简便、成本低廉、稳定性好且贮存方便，核酸疫苗只涉及到基因方面操作，既不象第1代减毒活疫苗那样需要放射线的防护设施，也不象第2代蛋白/多肽疫苗那样需要细胞培养、蛋白纯化等复杂过程。④使用安全，没有感染病原的危险，核酸疫苗仅仅是病原体某种抗原的基因片段，而不是整个病原体的基因，且利用质粒作载体，不涉及感染性因子。⑤免疫具有持续性，一次接种可获得长期免疫力，避免了灭活疫苗、重组亚单位疫苗等需多次加强免疫的繁琐。⑥同种异株的交叉保护作用，采用同种不同株之间的保守DNA序列作核酸疫苗，可以使其免疫作用突破地理株的限制，这在甲型流感病毒中已得到证实。 因此，核酸疫苗已在细菌、病毒、寄生虫等感染性疾病预防中显示出巨大的潜力。实验证明，DNA疫苗兼有重组亚单位疫苗的安全性和减毒活疫苗诱导全面免疫应答的高效力[2，3] 。核酸疫苗的研究正在成为一个新的发展方向。本文将着重介绍核酸疫苗的机理和在寄生虫病预防中的应用。

1 核酸疫苗的作用机理

1990年由Woff等首先提出裸露DNA技术，他们试图用化学方法促使小鼠的肌细胞吸收质粒DNA以产生新的蛋白质，设置的对照组在注射DNA时未加任何化学试剂。出人意料的是对照组动物肌细胞吸收了这种裸露质粒DNA并高水平地表达了外源蛋白质。1991年Wiiams等发现注入基因在体内表达的蛋白质可诱导免疫应答。 1992年Tang等的实验证实了Wiiams等的发现。1993年Umer等证实小鼠肌肉注射编码甲型流感病毒核蛋白的重组质粒后，可有效地保护小鼠抗不同亚型流感病毒的攻击。随后又有大量动物实验结果说明在合适的条件下，DNA接种后既能产生细胞免疫又能引起体液免疫。目前使用的有质粒DNA和mRNA两种表达载体。利用mRNA作疫苗可以解决DNA疫苗相关的一些安全性问题。因为mRNA存在时间较短，不会整合到染色体DNA中去，因而不会引起插入突变。已证明mRNA直接注入小鼠骨骼肌在体内导致报道基因的短暂表达。Martinon等将编码甲型流感病毒NP的mRNA用脂质体包封后直接经皮下和静脉内注入体内，有效地激发了抗病毒特异性的细胞毒性T细胞效应，而且mRNA翻译产生的NP蛋白能根据相应的MHC I型分子被加工成不同的抗原多肽。应当强调的是，mRNA并不能代替DNA疫苗，它不具备DNA的所有优点。其表达短暂而不能诱导长期的免疫力。另外，mRNA不如DNA稳定，其生产、贮存、运输所需费用都比DNA高。而质粒DNA性质较稳定，易于提取和保存，在体内表达时间长并可诱发较强的免疫应答，故更常用。与灭活疫苗、减毒活疫苗和重组基因工程疫苗不同，常用核酸疫苗的化学性质为双链环状DNA。对于其免疫机理，目前还不能完全诠释，只有根据实验资料推测与如下几方面有关。

1.1 核酸疫苗在骨骼肌细胞表达的外源抗原由抗原提呈细胞（APC）提呈 注射核酸疫苗后三天即可通过免疫组化方法检测到肌细胞表达的外源蛋白质抗原，但肌细胞并不能表达激活T细胞所必需的第二信号-B7，不能进行抗原提呈。动物实验结果表明，核酸疫苗在嵌合体小鼠诱导CTL应答受供骨髓小鼠MHC限制，嵌合体小鼠的骨骼肌细胞不能提呈抗原，只有供者骨髓细胞来源的APC才能提呈抗原。对严重联合免疫缺陷BALB/c小鼠分别肌注HIV、HSV核酸疫苗，三周后移植CB6F1小鼠脾细胞和骨髓细胞，小鼠能产生H-2b和H-2d限制性CTL，证明骨骼肌细胞来源的抗原能被CB6F1小鼠骨髓细胞中的APC吞噬、加工、活化CTL前体细胞。

1.2 核酸疫苗直接转染APC 以任何途径（皮肤、粘膜、肌肉等）接种核酸疫苗，都可能直接转染专业APC，如巨噬细胞、树突状细胞。核酸疫苗在APC内表达的蛋白质抗原作为“内源性抗原”，经胞浆内的蛋白酶降解成8～10个氨基酸组成的肽，被内质网膜上的抗原肽转运结构转入内质网腔，与MHCI类分子形成聚合体，经高尔基体到达APC膜表面，被T细胞的受体识别，这是诱导CTL应答最有效的途径。APC在肌肉组织分布较少，但极少量APC被转染即能诱导免疫应答，不到200个树突状细胞被核酸疫苗转染即可诱导抗体产生和CTL应答。

1.3 核酸质粒的免疫佐剂功能 近年发现细菌DNA本身也是一种免疫佐剂，可有效地激活免疫效应细胞。介导这一作用是一类具有特征性的短核苷酸序列，被称作免疫刺激DNA序列（Immuno-stimuatory DNA sequence,ISS）[14，15]。对DNA 的分段研究分离出一些引起NK细胞激活的ISS，这些序列绝大部分是由胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸为基元的寡聚体，其碱基排列大多遵循一种规律，这种特征性序列则称作为ISS。ISS的发现以及对其生物学功能研究的不断深入，扩展了人们对DNA生物学功能的新认识。同时，对ISS的研究也有望提供一种高效、低毒、适用于人类的新型佐剂。研究发现氨苄青霉素抗性基因含两个ISS，而卡那抗性基因无此序列。将带氨苄青抗性基因的半乳糖苷酶表达质粒pACB-Z或pACS-Z皮内注射小鼠能诱导强的体液和CTL免疫应答，以卡那抗性基因置换氨苄青抗性基因构成pKCB-Z进行免疫所诱导的抗体效价明显降低，不能测及CTL应答。将pUC19、pACB、pKISS-CB-Z和含ISS的寡核苷酸分别转染人外周血单核细胞，可检测到干扰素， 干扰素、IL-12的表达增高三倍，而pKCB或无ISS的寡核苷酸则无此效应。由于DNA疫苗可在机体内较长时间表达，局部形成抗原库，类似弗氏完全佐剂中矿物油存留抗原作用，同时质粒骨架中的ISS还可选择性地刺激Th1应答。因此，用于DNA免疫目的的质粒DNA(pDNA)从概念上可分为两个部分：①转录部分，指导相应的抗原蛋白在体内表达；②佐剂部分，辅助机体对抗原产生免疫应答。

1.4 核酸质粒的启动子 用于制备DNA疫苗的质粒通常是非复制型的真核表达质粒，它在宿主细胞内的表达水平与调控DNA表达的启动子关系密切。不同的启动子在不同机体组织中表达的水平可以显著不同，而表达水平的不同又直接影响免疫应答的强度和持续性。目前常用的启动子为巨细胞病毒CMV早期启动子和猿猴病毒SV40的早期启动子。Cheng等将8种启动子所调控的质粒DNA分别接种于真皮、表皮、肌肉、肝脏和腹腔中，利用编码产物荧光素酶表达活性来检测各启动子的调控能力。结果显示只有CMV在所有5种组织中都有很高的调控能力；PL和PEP只在真皮中的表达水平与CMV相似；mMT在表皮中的表达水平较高；RSV和SV40除在真皮中表达水平较低外，其它部位均有较高的表达；而AD不管在哪种组织中的表达水平均较低。Xiang等则专门比较了CMV和SV40早期启动子的调控水平，发现这两种启动子在体外实验中表达狂犬病毒糖蛋白的能力有着惊人的差异，CMV远高于SV40。如果通过小鼠的注射比较，这两种启动子调控的DNA疫苗却诱导出相似免疫效应。尽管在大多数哺乳动物细胞体外表达实验中，CMV早期启动子的转录效能高于SV40早期启动子，可在体内表达实验中发现，接种SV40启动子调控的质粒DNA表达糖蛋白的宿主细胞数目多于CMV启动子调控的质粒。

2 寄生虫核酸疫苗的研究状况

各种寄生虫病给人类健康带来严重危害已有目共睹，抗寄生虫感染是一个世界性公共卫生问题。作为综合防治措施之一的核酸疫苗研制已成为目前寄生虫病防治研究的热点之一。现有的寄生虫疫苗，包括基因工程蛋白疫苗，由于种种原因其保护率还不能令人满意，许多有关领域尚有待深入研究。核酸疫苗的出现给人类抗寄生虫感染带来了新希望。迄今为止，主要开展了对疟原虫、囊虫、血吸虫[20～23]及利什曼原虫 的核酸疫苗研究。

2.1 疟原虫核酸疫苗 疟疾疫苗的研制是疟疾防治中的重要内容，从70年代的全虫活疫苗，到80年代的基因工程亚单位疫苗（如MSP1、EMP1等）和化学合成多肽疫苗（如SPf66）,由于其激发的免疫反应低下，临床试验效果不佳。90年代核酸疫苗以其突出的优点，引起了研究人员的极大兴趣。Sedegah等用约氏疟原虫环子孢子蛋白（CSP）基因真核表达质粒肌肉注射小鼠后，同时产生抗环子孢子蛋白特异性抗体和CTL反应，两种反应的水平均高于减毒子孢子免疫的小鼠。接种DNA疫苗后，用5×105子孢子攻击感染后的肝期原虫负荷下降86%；经2～3次免疫接种的小鼠，再以102子孢子攻击，结果显示疫苗对68%的小鼠具有保护作用，说明核酸疫苗接种可用于抗疟疾感染。目前，用作疟原虫核酸疫苗研究的保护性抗原基因主要有：CSP、MSA1、MSA2、SSP2、HEP17、EXP1和RESA等。

1997年Buter等在Nature上报道了一项临床试验，以一种编号QS21的试剂为佐剂，接种含环子孢子疟原虫蛋白基因的核酸疫苗，结果7个志愿者经感染有疟原虫的蚊子的反复叮咬后有6人获得了保护。该项试验为寄生虫核酸疫苗应用于人体提供了宝贵的经验。

2.2 囊虫核酸疫苗 1997年文献报道了核酸疫苗在抗囊虫感染中的应用。将编码绦虫保护性抗原基因(45 W)分别克隆到真核质粒表达载体pcDNA3和羊腺病毒载体(OAV200)，构建成pcDNA3-45W核酸疫苗和OAV205 重组病毒疫苗，分别给羊注射核酸疫苗和重组疫苗后再注射常用的45 W亚单位疫苗，引起的免疫反应比单独注射核酸疫苗和重组病毒疫苗要强；先注射核酸疫苗再注射重组病毒产生的IgG1要比分别注射至少高65倍。这两种方法都能保护羊抵抗绦虫卵的攻击。

2.3 血吸虫核酸疫苗 Yang和Waine等分别通过对小鼠肌肉注射携带编码日本血吸虫副肌球蛋白、26和28 KDa谷胱甘肽-S-转移酶、钙网硬蛋白、磷酸丙糖脱氢酶、22.6 KDa膜蛋白、14 KDa脂肪酸结合蛋白基因质粒DNA（该6种蛋白分子为目前公认有希望的血吸虫疫苗候选分子），但仅仅副肌球蛋白核酸疫苗诱导了鼠特异性抗体的产生[20，21]。而Kayes等用曼氏血吸虫28 KDaGST核酸疫苗免疫小鼠，在血清中测有特异性抗GST IgG抗体。国内李传明等的实验结果也表明，日本血吸虫26 KDa GST-DNA疫苗免疫小鼠后能诱生一定水平的抗血吸虫抗体，免疫鼠可形成一定的预防血吸虫尾蚴感染的保护性免疫力;同时可减轻宿主肝组织血吸虫卵所致的病理损害作用。

2.4 利什曼原虫核酸疫苗 Xu等用含编码利什曼原虫GP63基因核酸疫苗pcDNA1-GP63直接免疫BALB/c鼠，检测到质粒在小鼠至少存在40天，抗体免疫组化染色显示高水平表达的GP63。硕大利什曼原虫攻击感染，发现鼠已产生高度抵抗力。利什曼原虫抗原能诱导免疫小鼠产生高水平细胞因子，通过Th1型细胞免疫抵抗攻击。BALB/c小鼠一般对利什曼原虫感染敏感，因为它不能激活Th1反应，除非加入外源性的IL-12[25，26]。

3 结论

核酸疫苗的发生、发展时间虽不长，却已取得了许多可喜的成就。它具备的许多优点如操作方法简便，能同时诱导机体产生高水平保护性的体液和细胞免疫力，且安全、持效，有抗各种病原体感染及抗肿瘤的广阔应用前景，正引起各有关研究领域学者的强烈兴趣。但在研制核酸疫苗时，一些潜在的问题也不容忽视，它还有诸多不完善之处，离实际应用仍有相当多的工作要去做。综合目前有关文献，认为今后应该重点探讨和研究的问题如下。

在设计核酸疫苗时，要注意避免重组的DNA会整合到宿主细胞染色体上的可能。该问题可能需经过长期动物实验观察和进一步的实验室细致研究予以解决。

是否会产生对注射的DNA本身的免疫反应，会不会产生抗DNA抗体，会不会造成自身免疫性疾病，尽管有文献认为可排除这些可能性，但对核酸疫苗的安全性仍需进一步进行深入而细致的研究。

目前对核酸疫苗的作用机制还不甚明了，深入研究核酸疫苗的作用机制，可使核酸疫苗的设计更趋合理，效果更显著，潜在危险性更小。

表达抗原在体内的高水平，长时间的存在对宿主机体的免疫功能有何影响；表达的时间与水平如何控制，控制到什么程度最佳。

在完成上述研究重点问题后，可应用大型哺乳动物或灵长类动物进行试验，之后可加快核酸疫苗商品化的进程，使其尽快产生经济效益和社会效益。