毛毕吸虫成虫分离方法的研究初报

PRELIMIARY STUDY ON THE METHODS OF SEPARATING

毛毕属（Trichobiharzia）吸虫为鸟类血吸虫，其尾蚴可侵袭人体引起变态反应性皮炎，该属吸虫宿主较多，家鸭是毛毕属吸虫主要的终宿主之一[1～10]。从家鸭体内分离出成虫，是研究其形态、结构并进行分类的重要基础。作者在淮河水系毛毕属吸虫研究的过程中，对毛毕吸虫成虫的分离方法进行了初步研究，取得了较为满意的结果，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病鸭 用毛毕属吸虫尾蚴（50条）人工感染的、并在院动物房内饲养30天以上的雏鸭（为当地居民孵化的家鸭）；购自当地居民（渔民及农民）于毛毕吸虫流行水域内放养1年以上的阳性家鸭。

1.1.2 药品器材 肝素（Ehter.批号：930407，上海浦江应用生物化学研究所。）乙醚（Diethyether，批号：960423，宜兴市第二化学试剂厂）、注射器、9号注射针头、吊瓶、解剖针、橡皮导管、玻璃导管、手术刀、剪等。

1.2 方法

1.2.1 肝门静脉、肠系膜静脉解剖法 将病鸭（其粪便经毛蚴孵化为阳性的家鸭）固定在解剖台上，用乙醚麻醉后，剖开胸腹部，将肝门静脉和肝静脉结扎，用眼科剪、解剖针和“0”号毛笔剖检肝门静脉和肠系膜静脉分离成虫。即从较细的肠系膜静脉开始，分段以解剖针刺破静脉，并以解剖针从静脉远端驱赶血液（成虫）从刺破处流出，用毛笔轻取流出血液至含有生理盐水的平皿中，用生理盐水反复清洗换水，直至虫体被洗净为止。最后在解剖镜下收集成虫。

1.2.2 在体肝脏灌注法 将病鸭（其粪便经毛蚴孵化为阳性的家鸭）固定在兔解剖台上，在翅根部静脉注射2m肝素钠（12500U），随即用乙醚麻醉后剖开胸腹部，暴露内脏（操作中应避免划伤心脏和肝脏）。接着在肝静脉出口远端和门静脉起始端各作一切口，分别插入导入管和导出管（上述两管可由普通玻璃吸管替代，其长短、粗细根据鸭子的大小与静脉的粗细选用）。将含有生理盐水的500m吊瓶，置于2.5m高处，通过输液皮条与导入管相连，接通生理盐水，生理盐水和成虫一起即可从门静脉导出管口流出（抬高导入端解剖台效果尤佳）。

当流出液中含有较多组织液和血液时，可在量杯中换水沉淀几次，每次5min。若流出液较清晰，立即吸入小培养皿内，在解剖镜下或用肉眼直接分检。

1.2.3 离体肝脏灌注法 将病鸭（其粪便经毛蚴孵化为阳性的家鸭）固定在解剖台上，在翅膀根部注射2m肝素钠。随即用乙醚麻醉后解剖，暴露内脏。用止血钳或缝合线分别夹（扎）住肝静脉和门静脉起始端，仔细分离肝脏，并移至平皿内。然后将连有生理盐水吊瓶的吸管慢慢插入肝静脉内，接通生理盐水进行灌注，将门静脉流出液倒入300m量杯内，沉淀，换水2次，缓慢弃去上液，沉淀液倒入小平皿内，在解剖镜下或手持放大镜用肉眼直接分检。

1.2.4 肝门静脉及肠系膜静脉同时灌注法 将病鸭（其粪便经毛蚴孵化为阳性的家鸭）固定在解剖台上，在翅膀根部注入2m肝素钠，雏鸭酌减，用乙醚麻醉后，迅速打开胸腹腔，暴露内脏。用止血钳夹住肝静脉，将连有生理盐水吊瓶的9号针头插入降主动脉内，随后将门静脉起始端剪断，用一漏斗放于大、小肠的下方。接通生理盐水，流出液经尼龙网过滤，将阻留物翻入含生理盐水的培养皿中，直接镜检。

2 结果

2.1 肝门静脉系统和肠系膜静脉解剖法 分别解剖人工感染毛毕吸虫尾蚴的雏鸭和在当地流行区自然感染的家鸭各20只，共分离到完整的成虫388条（雌虫349条，雄虫39条）。其中从人工感染毛毕属吸虫尾蚴的雏鸭体内共分离成虫138条（雌虫127条，雄虫11条），每只雏鸭检获成虫数目不等，最少3条，最多26条，平均6.9条；从自然感染的家鸭体内共分离成虫250条（雌虫194条，雄虫56条），每只家鸭检获的成虫2～72条，平均12.5条。从40只家鸭体内均分离到活体成虫，此外尚有部分虫体断片。

2.2 在体肝脏灌注法 分别灌注人工感染毛毕吸虫尾蚴的雏鸭20只和在当地流行区自然感染的家鸭35只。共分离成虫2546条（雌虫1393条，雄虫1153条）。其中从人工感染毛毕属吸虫尾蚴的雏鸭体内检获成虫699条（雌虫249条，雄虫350条），每只雏鸭检获成虫5～38条，平均34.95条；从自然感染的家鸭体内共检获成虫1847条（雌虫932条，雄虫915条），每只家鸭检获成虫12～86只，平均52.77条。从55只家鸭体内分离到的成虫均为活虫。

2.3 离体肝脏灌注法 分别灌注人工感染的病鸭6只和自然感染的病鸭10只，共分离成虫2495条（雌虫1215条，雄虫1280条）。其中人工感染的病鸭检获成虫192条（雌虫95条，雄虫97条），每只人工感染的病鸭检获成虫22～41条，平均32条；从自然感染的病鸭检获成虫2303条（雌虫1006条，雄虫1297条），每只病鸭检获成虫186～315条，平均230.3条。从16只病鸭检获的成虫均为活虫。

2.4 肝门静脉及肠系膜静脉灌注法 分离人工感染的雏鸭10只和在流行区购买的阳性家鸭10只，分别检获成虫448条（雌虫197条，雄虫251条）和2554条（雌虫1231条，雄虫1323条）。每只人工感染的病鸭检获成虫22～56条，平均45条；每只购自流行区的阳性家鸭检获成虫194条～396条，平均255条。从20只病鸭所分离的成虫均为活虫。

3 讨论

毛毕属吸虫的终宿主主要为家鸭和绿头鸭、绿翅鸭、斑嘴鸭和斑背潜鸭、苍顶夜鹭等候鸟[1～10]，其中家鸭是人们研究毛毕属吸虫常用的实验动物，无论是研究其生活史、分类还是流行病学调查都用家鸭作为成虫的动物模型。据以往文献记载，从家鸭体内分离毛毕吸虫，多采用肝门静脉、肠系膜静脉解剖法，而肝脏灌注法收集毛毕吸虫成虫，尚未见报道。从本次研究结果可见，肝门静脉、肠系膜静脉解剖法手工操作分离成虫较慢，费时费力，从解剖1只病鸭到其中的成虫分离完毕，一个人要花4～6h，因虫体较小，又与血液混合在一起，分离时不易看清，易漏检，且血凝后无法进行操作。因此，该方法成虫收集率低。应用肝脏灌注法（无论是采取在体灌注，还是离体灌注），从解剖1只病鸭到成虫分离完毕，一个人仅需用1～2h。因此肝脏灌注法与常规的肝门静脉、肠系膜静脉解剖法相比较，具有省时、省力，所获成虫虫体完整、洁净、便于活体测量和操作简便等优点，且成虫收集率也明显增高。因为鸭肝静脉位于心脏的背面，粗而短；门脉位于肠系膜中，既细又短，在体灌注有一定困难。因此，离体肝脏与在体肝脏灌注两者相比，前者更便于操作。但在离体肝脏灌注时，若操作不熟练、分离肝脏的时间长，可导致肝门静脉内血液凝固，灌洗出的虫体包裹在血凝块中，检出率将大受影响、甚至检不出成虫。由于鸭肝很脆弱，易损伤，故在灌注前插管和分离肝脏时，应细心操作。若操作不慎，肝脏出现裂损，可降低肝脏内的灌注压力，从而影响灌洗效果，使虫体不能全部冲出。较高的灌注压力和完整无损的鸭肝是灌注成功的关键。

虽然肝脏灌注法大大地提高了收集成虫的效率，但是，寄生于肠系膜内的成虫无法冲出，采用肝门静脉和肠系膜静脉同时灌注法较好地解决了这个矛盾，无疑是毛吸虫分离方法上的一大进步。

由于灌注法具有常规肝门静脉、肠系膜静脉解剖法不可比拟的优点，建议此方法应用于家畜（牛、羊）体内东毕吸虫成虫的分离。常规收集家畜东毕吸虫成虫的方法有二种：一是牛或羊肝门静脉解剖法；二是将牛或羊肝用刀切数下而不切穿，放于筛筐内冲洗，同时用手挤压20min，将筛内容物洗入量杯，用水反复沉淀，取沉淀渣检查虫体，费力、费时。应用灌注法可能会克服上述不足，产生更好分离效率。

关于毛毕吸虫在鸭体内的寄生部位，根据唐仲璋，唐崇惕（1962）报道，毛毕吸虫除寄生在门静脉和肠系膜静脉外，还可以寄生于肺和心脏。解剖9只鸭子共收集毛毕吸虫成虫233条，其中186条（79.83％）寄生于肝门静脉和肠系膜静脉，25条（10.73％）和22条（9.44％）分别寄生于肺部及心脏。因此要计算鸭体虫荷的多少，应对病鸭进行较细致的解剖和灌注，才能较客观地了解其毛毕吸虫感染度。作者已初步尝试采用肝脏和肠系膜静脉灌注法及灌注后再对肺、心进行解剖分离家鸭体内的毛毕吸虫成虫，此项工作尚待进一步完善、总结。此方法对于了解毛毕吸虫的分布和不同部位雌雄虫的比例具有价值。

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