榄香烯乳对宫颈癌HeLa细胞的放射增敏作用

[Key words] Cervica cancer; HeLa ces; Eemene; Radiosensitization

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年大约有50万新发病例，80%的新发病例在发展中国家。我国是宫颈癌高发国之一，患病率和死亡率均约占全世界1/3。近年来宫颈癌的发病率有上升趋势，尤其在年轻女性宫颈癌发病率逐年提高，且中、晚期患者较多，预后不佳。宫颈癌的主要治疗手段为放疗、手术，手术为主的综合治疗仅限于Ⅱa期以早的病例，宫颈癌一般发现时分期较晚，丧失了最佳手术治疗的机会，因此放疗在宫颈癌的治疗中起着十分重要的作用。

提高肿瘤细胞对放射线的敏感性，在适当降低放疗总剂量的同时，提高肿瘤治愈率及减少并发症、后遗症，一直是临床研究的重点。近年来，榄香烯抗肿瘤方面的作用得到较多关注，但一般作为化疗辅助药物，放疗增敏的研究报道较少。本文通过榄香烯乳对宫颈癌HeLa细胞和裸鼠移植瘤的放射增敏作用的研究，为其在宫颈癌放射治疗中的临床应用提供依据，现报道如下。

1材料与方法

1.1实验材料

DMEM培养基（Gibco公司）、类胎牛血清（Hycone公司）、100×青-链霉素（杭州昊天生物技术有限公司）;细胞凋亡试剂盒（联科生物公司）;DAPI（Sigma，D9452）、Bax antibody（Abcam，ab32503）、Bc-2 antibody（Abcam，ab32124）、Aexa FuorR 488 Donkey anti-rabbit IgG （Life，1723019）、榄香烯注射液（大连华立金港药业有限公司，规格：20 m∶0.1 g/支，批号：1508161，有效期至2018年7月）、戊巴比妥钠（SIGMA，140418）、Ⅸ 73型显微镜（OLYMPUS公司）、ECLIPSE Ti-S型倒置显微镜（Nikon公司）、Hea细胞（赫贝科技细胞库复苏）。 1.2实验方法

1.2.1克隆形成实验

1.2.1.1细胞增殖部分 取对数生长期的HeLa细胞接种于培养板，每孔500个细胞。加入含不同浓度（0、10、20、40、80、160 μg/m）的榄香烯乳培养液培养。培养后培养板置于光镜下观察，计数>50个细胞数的集落数。按以下公式计算：药物作用后集落存活率=某一浓度药物组作用后集落数/该组细胞种植数。一共6组，每组3个重复，1个时间点。

1.2.1.2放射增敏部分 取对数生长期的HeLa细胞接种于培养板，每孔1000个细胞;加入或不加入40 μg/m的榄香烯乳培养液培养;24 h贴壁后再用铱192核素进行辐射，分别辐射0、0.5、1、1.5、2 Gy。培养15 d后，将培养板置于光镜下观察，结晶紫染色，计数>50个细胞数的集落数。按以下公式计算：药物作用后集落存活率=某一浓度药物组作用后集落数/该组细胞种植数。一共6组，每组3个重复，1个时间点。

1.2.2细胞凋亡检测

取生长状态良好的HeLa细胞，铺6孔板，每孔加入1×105个细胞，放入培养箱中静置24 h。用40 μg/m的榄香稀乳处理HeLa细胞，于24 h和48 h后收集细胞检测细胞凋亡。药物作用后，离心收集细胞，PBS洗涤细胞两次，用500 μ 1×Binding Buffer悬浮细胞，在细胞悬浮液中加入5 μ的Annexin V-FITC和10 μ的PI，轻轻混匀后于4℃避光条件下孵育5 min，上流式细胞仪检测。

1.2.3细胞免疫荧光检测

取对数生长期的HeLa细胞，以每孔5×104个细胞种植至24孔板，放入培养箱中培养，待细胞贴壁。①对照1组：不做任何处理，正常培养。②24 h培养组：加入40 μg/m的榄香烯乳培养液培养24 h。③48 h培养组：加入40 μg/m的榄香烯乳培养液培养48 h。各组细胞，PBS洗3次，4%多聚甲醛室温固定30 min;PBS洗3次，0.5%的Triton室温破膜20 min;PBS洗3次，5%的BSA室温封闭1 h;PBS洗3次，分别加入相应一抗，4℃过夜;PBS洗3次，分别加入相应荧光二抗，室温避光孵育1 h;PBS洗3次，加入10 nm浓度的DAPI染料，室温避光孵育5 min;PBS洗3次。在200倍荧光显微镜下，观察蛋白荧光强度。

1.2.4实验动物及饲养条件

实验动物：30只4～5周龄裸鼠由上海莱克斯实验动物有限责任提供，接收时动物体重为16～18 g，生产许可证号：SCXK（沪）2012-0002，合格证号：0278762，SPF级。饲养环境：温度范围20～25℃，相对湿度范围40%～70%。

1.2.5荷瘤的小鼠制备及其处理方法

取对数生长期HeLa细胞，调整细胞浓度至2×106/m，以1 m空针将细胞悬液吹打混匀后，取0.2 m接种于裸鼠右侧腹股沟皮下，含细胞数4×105个/只。观察接种部位液体吸收、肿瘤生长过程及裸鼠状况，待肿瘤生长至直径>1 cm时，30只荷瘤裸鼠按肿瘤体积随机分为两组，即：治疗组和对照2组，每组各15只。治疗组腹腔内注射榄香烯，剂量为100 mg/kg，对照组给予0.2 m生理盐水。两组动物分别于1、4、7、10、13、16、19、22 d给药，每次给药前称量鼠重，调整给药剂量，同时测量肿瘤体积，并分别于第4、7、10、13、16、19、22 d给药后2 h进行放疗，条件为：裸鼠仰卧位固定，腹股沟部照射野大小为2 cm×3 cm（根据肿瘤大小进行调整），肿瘤表面覆盖厚填充物，铱192核素照射，照射剂量为DT 2 Gy/F，3 min。

1.2.6检测指标

各组裸鼠于给药后第3天称重并测量瘤块体积，1次/3 d，用游标卡尺测量瘤体的最长径（a）和最短径（b），计算肿瘤体积（V），单位cm3，V=1/2 ab2=0.5 ab2，绘制肿瘤生长曲线。动物体重：每3天测量1次动物总重，动物体重=总重-肿瘤体积（假设肿瘤密度为1）。处死动物，分别称体重和瘤重，计算：瘤体积抑制率=（1-试验组平均瘤体积/对照组平均瘤体积）×100%;瘤重抑制率=（1-试验组平均瘤重/对照组平均瘤重）×100%，停止照射后3 d，处死裸鼠，剥离肿瘤，部分-80℃保存，部分4%甲醛固定，用于后续检测。

1.3统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验;采用Graph Pad Prism统计软件进行多组均数分析，先对数据进行方差齐性检验，若方差齐，采用单因素方差分析进行总体比较，用多个剂量组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据改用秩和检验进行统计;计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1榄香烯乳对HeLa细胞增殖能力的影响

2.2榄香烯乳对HeLa细胞周期及凋亡的影响

通过流式细胞仪检测细胞周期及凋亡，分析发现榄香烯可改变HeLa细胞周期的分布，当40 μg/m榄香烯处理48 h后，G2/M期细胞比例低于处理0 h，凋亡率高于处理0 h;处理24 h后，G1期细胞比例高于处理0 h，S期细胞比例低于处理0 h;处理48 h后，G1期细胞比例低于处理0 h，S期细胞比例高于处理0 h，差异有统计学意义（P<0.05），提示榄香烯可使Hea细胞周期阻滞于S期，阻断细胞由S期向G2/M期的进程，阻滞细胞的有丝分裂，使细胞发生S期阻滞，促使HeLa细胞凋亡。

2.3欖香稀乳对HeLa细胞Bc-2和BAX表达的影响 浓度为40 μg/m的榄香烯乳诱导HeLa细胞BAX表达升高，Bc-2表达下降，随时间延长，作用越明显。提示榄香烯乳通过调节细胞内Bc-2蛋白的表达，经线粒体信号转导途径，促进HeLa细胞的凋亡（图3，见封四）。

2.4榄香烯乳对HeLa细胞放射增敏作用的影响

克隆形成实验检测HeLa细胞在不同剂量的辐射下的克隆形成能力，结果提示，随着辐射剂量的增加，HeLa细胞克隆形成能力显著降低;与-榄香稀乳组比较，经榄香稀乳处理组（+榄香稀乳组）显著增加了HeLa细胞对放射的敏感性，相同剂量下，增殖抑制能力的降低更为显著（图4，见封四）。

2.5榄香烯乳对裸鼠放射增敏作用的影响

30只裸鼠，除1只裸鼠肿瘤未长出外，其余裸鼠均成瘤，成瘤率为96.7%（29/30）。部分裸鼠于接种肿瘤20 d左右，肿瘤出现破溃现象。治疗组裸鼠给予榄香烯后，即刻出现不适，先为挣扎、聚堆、趴伏，半小时左右恢复正常。放疗后动物状态未出现异常，饮食活动均正常。

与对照2组比较，治疗组裸鼠的体重在给药后13 d和22 d显著降低，差异有统计学意义（P<0.05），肿瘤体积在给药后25 d显著减小，差异有统计学意义（P<0.05），治疗组裸鼠的瘤重明显降低，提示榄香烯联合放疗治疗效果优于单纯放疗干预。

3讨论

根据宫颈癌的腔内肿瘤的特点，铱192核素行后装腔内放疗是最常用的放疗手段。但射线在杀伤肿瘤细胞的同时，也损伤正常的组织和细胞，人们希望通过提高肿瘤细胞对射线的敏感性，提高放疗效果，减少并发症及后遗症。

中草药具有毒性小，药源广的特点，可用作放射增敏剂的品种也很多，我国开展这方面的研究有十分优越的条件。榄香烯已证实具有抑制肿瘤生长的作用，但作为增敏剂在宫颈癌治疗中的作用研究甚少。

本研究发现，榄香烯乳抑制HeLa细胞增殖及促进细胞凋亡，且呈一定浓度及时间依赖性，与其将HeLa细胞周期阻滞于S期，阻断细胞由S期向G2/M期的进程，阻滞细胞的有丝分裂有关，其凋亡途径可能与调节细胞内Bc-2蛋白的表达经线粒体信号转导途径促进HeLa细胞凋亡有关。此外，在体内外均证实榄香烯乳促进HeLa细胞对放射射线的敏感性，显著促进同等剂量辐射下，抑制肿瘤生长及促进细胞死亡的作用。

综上所述，榄香烯可以作为宫颈癌放射增敏剂，与放疗联合使用，提高治疗效果，减少不良反应，值得推广应用。