胆囊良恶性肿瘤中P16蛋白表达及临床意义

To study the expression of p16 protein and discuss its cinica significance in benign and maignant gabadder tumors

P16基因是多重肿瘤的抑制基因（MTS1），位于人类染色体qp21区位上，全长为8.5kb,其编码分子量为15.84kD的蛋白质P16，P16基因是一种CDKS抑制蛋白基因，其表达蛋白通过与CDK4的特异的结合来抑制该蛋白激活酶的活性，阻止细胞从G1期到S期，从而抑制细胞增殖。当其发生突变或缺失时，调控细胞周期的抑制因子P16不能正常表达，导致细胞增殖失控，而发生肿瘤形成。本文探讨其P16蛋白表达与胆囊肿瘤的发生、发展关系及临床病理特征。

1 材料与方法

1.1 材料

由上海市瑞金医院集团闵行医院病理科提供2001年1月～2005年12月外科手术存档蜡块标本，胆囊癌46例，其中乳头状腺癌16例，管状腺癌24例，粘液腺癌6例。胆囊腺瘤20例。对照组胆囊正常黏膜24例。所有病例均经HE染色病理诊断证实。

1.2 方法

石蜡存档标本分别切片，厚4μm,分别作免疫组化既用型二步法染色。用已知的阳性切片作阳性对照。P16蛋白的阳性表达定位于细胞浆或细胞核内呈棕黄色颗粒。阳性细胞数的细胞核或浆有棕色＜25%及无着色为（-）；阳性细胞数在25%～50%为（+）；阳性细胞数＞50%为（++）。

1.3 统计学方法

统计学处理采用卡方及秩和检验。

2 结果

2.1 P16蛋白的表达与胆囊良恶性病变中的关系

见表1。P16蛋白在胆囊癌组中阳性表达率53.0%（24/46），与胆囊良性病变组的比较差异有显著性（P＜0.05），而胆囊腺瘤组与胆囊正常黏膜间的阳性率差异无显著性（P>0.05）。表1 P16蛋白表达与胆囊良恶性病变关系（略）注：与胆囊黏膜组比较，?P＜0.05，△P＞0.05

2.2 P16蛋白的表达与胆囊癌病理分型及分化程度的关系

见表2，P16蛋白在胆囊粘液腺癌中阳性表达34.0%(2／6),与胆囊管状腺癌组和乳头状腺癌组比较有明显差异性(P＜0.05)。在低分化癌组的阳性表达比高、中分化癌组低，差异均有显著性（P＜0.05），提示P16蛋白表达与胆囊癌组织学类型的恶性程度及分化程度相关。表2 P16蛋白表达与癌病理分型及分化程度的关系（略）注：P＜0.05

2.3 P16蛋白的表达与Nevin分期的关系

P16蛋白的表达在胆囊癌S4～S5期中阳性表达29.0%（4/14），与S3期和S1～S2期间均有差异性，提示了P16蛋白表达在胆囊癌的病程晚期表达率更低（P＜0.05），见表3。表3 P16蛋白表达与Nevin分期的关系（略）注：P<0.05

3 讨论

肿瘤的发生发展是一个复杂的多阶段过程，多种基因和多种分子水平变化与之密切相关。不仅同细胞程序性凋亡及肿瘤的发生、发展、浸润、转移等有密切相关，同时也参与细胞间的信息传递，或成为细胞内的第二信使，并行使辅助分子功能，将细胞外信息传至细胞质及细胞核，调控基因表达。

胆囊癌占整个消化系统恶性肿瘤的第五位，与肝外胆管癌相比其临床症状相对稳袭，多表现为腹胀、嗳气等一般消化症状，腹痛黄疸少见，不易及早发现，且转移发生早，故预后差。与预后有关的因素目前已知的有临床分期、手术切缘、组织学分级、DNA含量的测定及多种癌基因异常表达等密切相关。

P16基因是Serrano、Kamb首次报道的一种新型肿瘤抑癌基因，其完整编码序列包括2个内含子（intron1和intron2）和3个外显子，其中5′端126bp区域为外显子1（exon1）中间307bp为外显子2（exon2）,3端11bp区域为外显子3（exon3）。P16抑癌基因由3个外显子组成，编码为156个氨基酸，其作用越来越受人们的重视，它与多种恶性肿瘤的发生、发展有关，故称为多重肿瘤抑制基因（MTS1），已被国际基因组织命名为（DKN2）基因[6，7]。Kamb等研究发现人类的多种肿瘤及其转化细胞系均存在较高频率的P16基因缺失。有研究报道，把野生型P16基因转换给P16基因缺失的肿瘤细胞系时肿瘤生长明显受抑。另外，大量文献报道P16在G1期与Cycin D、CDK4或CDK6以及PRB共同形成反馈环调节细胞周期的运转。CDK4或CDK6与Cycin D结合而被激活继而磷酸化PRB，从而激活转录因子E2F促使S期特殊的基因表达。P16与Cycin 竞争结合CDK4和CDK6，抑制CDK4和CDK6的活化，使细胞停滞于G1期，从而抑制细胞增生和恶性转化。当P16基因缺乏或突变而不能正常表达时，细胞则失去控制发生癌变。这种抑癌基因的突变或缺乏，并且广泛存在于各种消化系肿瘤中，在食管癌、胃癌、胰腺癌等肿瘤中都检测到P16基因的高频突变及缺乏[11，12]，在原发性胆管癌中发现P16基因突变为63%，突变率较P53（1/16）和Kras基因（1/25）高。提示在消化系肿瘤的发生、发展中P16基因的纯合子缺失比基因突变发挥了更重要的作用[11，12]。

实验结果显示，P16蛋白的表达主要位于胆道系统及其肿瘤细胞核和细胞浆，少部分发现仅有细胞浆着色而核未着色，这与P16蛋白在食管癌、胃癌、胰腺癌细胞着色情况相一致。本组的胆囊腺瘤和胆囊正常黏膜组中P16蛋白均有较高的阳性率，而二者间的P16蛋白阳性率比较差异无显著性。在胆囊癌组中S1～S2期的P16蛋白表达无明显下降，直至S4～S5期方明显下降。由此提示P16基因突变与失活，并不是发生于胆囊癌的早期。而是发生在胆囊癌的中晚期。在胆囊癌组中P16蛋白的阳性率明显低于胆囊腺瘤与正常黏膜组的阳性率（P＜0.05）。发生在胆囊外转移，例如肝转移时的S4～S5期P16蛋白阳性表达率低于未发生转移的S1～S2期及良性病变黏膜组，统计学上差异均有显著（P＜0.05），表明P16蛋白的低表达与胆囊癌的发生和发展密切相关。说明P16基因的失活是胆囊癌细胞因失控而加速，尤其在肿瘤发生晚期的这种机制更明显，故P16基因可为肿瘤进展的重要指标之一。结果还显示，在低分化胆囊癌组P16蛋白表达显著低于高、中分化癌组（P＜0.05），提示了P16阳性表达与胆囊癌的恶性程度及分化相关，可作为胆囊癌的预后判断指标之一。

P16基因在许多肿瘤研究中已得到证实。国外研究报道显示：P16基因突变可能与Nscc病例的临床分期有关。国内有报道：P16基因突变与Nscc的发生发展可能有一定的关系，且与发生在晚期及转移有关。显然对胆囊癌中P16基因蛋白的表达，可为临床诊断及预后判断提供一个有效手段的指标依据。

1王继旺.非小细胞肺癌P16基因突变的初步研究.中国肿瘤杂志.1999,7：546-547.

2高学硕.P16蛋白在乳腺癌中表达状况及生物学意义.实用肿瘤杂志.2000.15（2）：93-95.

3NerinJ,MoranTJ,Kays,eta.Carcinomaofthegabadder.Stagingtreatmentandprognosis.Cancer,1976,37(2):141.

4回允中译.阿克曼外科病理学.第八版.沈阳：辽宁教育出版社.1999.959.

5SerranoM,HannonGT,BeachD.AnewreguatorymotitincecycecontrocausingspecificinhibtionofcycinD/CDK4.Nature,1993,366:704-707.

6KambA,CruisNA,Wearer-FedausJ,eta.Acecycereguatorpotentiayinvovedingenesisofmanytumortypes.Science,1994,264:436-438.

7ArapW,NiishiKauaR,FumariFB,eta.Repacementofthep16/CDKN2genesuppresseshumancegrowth.CancerRes,1995,55:1351.

8NishikawaR,FurnariFB,LinH,eta.Lossofp16INR4expressionisfrequentinhighgradegiomas.CancerRes,1995,55:1941-1945.

9KambA.Ce-cycereguatorsandcancer.TrendsGenet,1995,11:136-140.

10XiongY,ZhangH,BeachD.Subunitrearrangementofthecycin-dependentkinasesisassociatedwithceuartransformation.GenesDeN,1993,7:1572-1583.

11吕有勇.多基因变异与胃黏膜细胞癌变的关系.中华消化杂志.1996.16：9-13.

12吕有勇.高崇峰.崔建涛.等.胃癌中MTS1/P16基因缺乏及表达异常的研究.中华肿瘤杂志.1996.18：189-191.

13MajimaT.CancerLett,1997,118(1):47-53.